Experiencia y Recursos

Para este proyecto, contamos con la experiencia de químicos médicos, farmacólogos, y biólogos moleculares y celulares, lo que nos permite cubrir todas las fases clave en el desarrollo de nuevos compuestos con potencial actividad terapéutica para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. El consorcio tiene una amplia experiencia en el modelado molecular, el diseño y la síntesis de compuestos multidiana que inducen NRF2, el desarrollo de fármacos neuroprotectores y el estudio de las bases moleculares que subyacen a las enfermedades neurodegenerativas.

Unidad de Microscopía Computacional (UMICO)

La Unidad de Microscopía Computacional (UMICO) emplea modelos de simulación molecular computacional en diferentes escalas de resolución para abordar una amplia gama de cuestiones biológicas. El principal foco de investigación es el desarrollo de nuevas terapias para enfermedades neurodegenerativas (enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple e ictus). Las aplicaciones van desde la predicción del diseño molecular asistido por computadora hasta las propiedades biofísicas.
Nuestras técnicas in silico incluyen:

– Cribado virtual

Cribado in silico basado en la estructura
Cribado in silico basado en la unión a ligando.

– Diseño de fármacos.

Diseño de novo.
Rediseño basado en la naturaleza de la zona activa.

– Reposicionamiento de fármacos

Reposicionamiento y búsqueda de otras dianas potenciales para un compuesto dado.

– Docking.

– Modelado por homología.

– Dinámica molecular a nivel multi-escala: atómico y de grano grueso.

– Predicción de estructuras 3D de ADN / ARN

Hemos implementado un sistema computarizado de almacenamiento de muestras para el cribado farmacológico («biblioteca de química») en el que se registran todos los estudios realizados para cada uno de los compuestos

Síntesis Química

Contamos con la experiencia y recursos necesarios para la síntesis y purificación de compuestos orgánicos de alta calidad. Nuestro equipamiento incluye:

Sintetizador de microondas para reacciones químicas que ahorra tiempo y costes de energía (Estrada Valencia et al. Eur. J. Med. Chem. 2018, 156, 534-553).
Equipo de síntesis en fase sólida para obtener compuestos con velocidad, simplicidad, alta eficiencia y rendimiento (Monjas et al. Eur. J. Med. Chem. 2017, 130, 60-72).
Equipo de síntesis paralela (carrusel) que aumenta la velocidad en la búsqueda de las condiciones experimentales más adecuadas para una reacción dada.
Equipo automatizado de cromatografía preparativa (IsoleraBiotage) para la rápida separación y purificación de nuevos compuestos. En solo 10-15 minutos y con un volumen reducido de solventes, este equipo permite obtener compuestos finales con la pureza requerida (> 95%) para su evaluación biológica.
Equipo analítico de HPLC para determinar la pureza de los compuestos.
Equipo de HPLC semi-preparativo para la separación de mezclas complejas en medios acuosos.
HPLC-MS que permite la determinación rápida de la pureza y la identificación de compuestos mediante la combinación de un equipo de HPLC y un espectrómetro de masas.
Cinco equipos de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de 300 a 600 MHz, para la caracterización estructural de nuevos compuestos.
Espectrómetro de masas de alta resolución (HRMS) para determinar la masa molecular exacta de un compuesto dado.

También hemos creado una biblioteca química de casi 1000 compuestos con estructuras privilegiadas para actuar en el sistema nervioso.

Evaluación Farmacológica in vitro

Para este Proyecto hemos desarrollado y puesto a punto varios protocolos propios para los ensayos in vitro, además de otras técnicas ampliamente usadas en biología molecular:

Equipo de resonancia de plasmones superficiales (RSP) para estudiar las interacciones proteína-proteína y proteína-molécula pequeña.
Métodos experimentales para la evaluación de propiedades biológicas (LOX5, QR2, ORAC, BACE1, GSK3beta, MAOA / B) y farmacológicas (pKa, logP, solubilidad en medios de tipo fisiológico).
Evaluación in vitro de la permeabilidad del SNC a nuevos compuestos mediante la metodología PAMPA-BBB (Rodríguez-Franco et al. J. Med. Chem. 2006, 49,459-462). Selección in vitro de compuestos inductores basado en un enfoque químico-genético con proteínas fluorescentes (patente pendiente).
Evaluación en células AREc32 que expresan una luciferasa testigo dependiente de NRF2 (Sci Rep 2017, 7: 45701).
Evaluación de la toxicidad neuronal y hepática en líneas celulares humanas SHSY5Y y HepG2.
Evaluación del efecto neuroprotector y antineuroinflamatorio en células SHSY5Y y dos modelos de toxicidad: (i) Ácido okadaico y (ii) combinación de rotenona y oligomicina A. Para medir el componente antineuroinflamatorio, utilizamos cultivos primarios de glía de rata expuesta al estímulo proinflamatorio LPS, utilizando la técnica de Griess para medir la generación de nitritos (procedimiento interno, Sci Rep 2017, 7: 45701).
Evaluación del potencial terapéutico en cultivos de hipocampo organotípicos. Este modelo permite reducir la cantidad de animales necesarios, los costos económicos y los esfuerzos humanos. (Procedimiento interno, Buendia y col., Mol Neurobiol. 2016 Jul; 53(5):3338-3348).

Modelos in vivo.

AAVTAU, basado en el uso de vectores adenoasociados de expresión neuronal de la proteína TAU (P301L) bajo el control de promotor de sinapsina1 (AAV6TAU (P301L)). Este modelo tiene tres ventajas principales: a) permite estudiar el proceso neurodegenerativo en respuesta a una alta expresión de TAU, b) se pueden usar en diversos fondos genéticos, y c) permite estudios farmacológicos más cortos (aproximadamente 4 semanas) en comparación con el uso de ratones transgénicos donde el fármaco debe aplicarse durante varios meses. Tenemos dos variantes dentro de este enfoque:
– AAVTAUIH: administración estereotáxica en el hipocampo derecho (LastresBecker et al., Brain 137 (Pt 1): 7891.2014).
– AAVTAUICV: administración estereotáxica intracerebroventricular (publicación en curso).
APPTAU + NRF2: ratón C57 / bl / 6 que expresa las proteínas APP (V717I) y TAU (P301L) bajo el control del promotor neuronal Thy1. Estos ratones expresan ambos transgenes en presencia (ATNrf2 + / +) o ausencia (ATNrf2 -/-) de NRF2 (protocolo interno, Autophagy. 2016, 2,: 1902; Redox Biol. 2017, 13, 444).

Otros análisis.